摘要】 目的 應(yīng)用物體識(shí)別方法研究 D2半乳糖長(zhǎng)期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力 ,并比
較物體識(shí)別方法與 Morris水迷宮方法對(duì)該模型測(cè)試的靈敏性。方法 C57BL/ 6 小鼠 ,隨機(jī)分成正常對(duì)照
組、 D2半乳糖低劑量組(50mg/ kg ,sc) 、 D2半乳糖高劑量組(100mg/ kg ,sc) ,連續(xù)造模 8 周。以物體識(shí)別方法
和 Morris水迷宮方法測(cè)試各組動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果 在物體識(shí)別測(cè)試中 , D2半乳糖高劑量組分辨
指數(shù)(15. 71 ±3. 94)較對(duì)照組(45. 89 ±7. 41)減低具有非常顯著性意義 ( P < 0. 001) ,低劑量分辨指數(shù)
(24. 69±6. 25)與對(duì)照組的差異也存在顯著性意義( P < 0. 05) 。在 Morris水迷宮測(cè)試中 ,D2半乳糖高劑量
組動(dòng)物逃逸潛伏期比對(duì)照組延長(zhǎng)有顯著性意義( P < 0. 01) ;高劑量組在目標(biāo)象限空間探索所停留時(shí)間與
游泳距離比均較正常對(duì)照組減少有顯著性意義( P < 0. 05) 。結(jié)論 D2半乳糖可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)顯著的物體
識(shí)別能力障礙 ,用物體識(shí)別測(cè)試方法比 Morris水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。
【關(guān)鍵詞】 D2半乳糖; 學(xué)習(xí)記憶; 物體識(shí)別; 水迷宮; 腦老化
Impairment of object recognition in aging model induced by D2galactose W EI Hai2f eng , SON G Qiu2jie , A I
Hou2xi , et al . Department of Pharmacology , Xuan2w u Hospi tal of Capi tal Universi ty of Medical Sciences ,
Beijing Key L aboratory f or B rain A ging , Beijing 100053 , China
【Abstract】 Objective To study the object recognition impairment in D2galactose (D2gal) induced aging
model with object recognition test (ORT) , and compare the ORT and Morris water maze (MWM) in testing
learning and memory in this model . Methods C57BL/ 6 mice divided into groups of cont rol , D2gal (50mg/ kg)
and D2gal (100mg/ kg) . Each mouse was t reated with vehicle or D 2gal (s. c. ) once per day for 8 weeks. The
ORT was used to test the object recognition preference and MWM for s patial learning and memory ability. Re2
sults For ORT , D2gal groups of both doses showed significantly less exploration time on new object ( P < 0.
05) ; the discrimination index (DI) of high dose showed very significant lower DI ( P < 0. 001) , and low dose
showed significant lower DI ( P < 0. 05) , compared with cont rol group. During 42day spatial learning and mem2
ory t raining in MWM , high2dose D2gal group showed significant longer escape latency (P < 0. 01) ; in the probe
t rial , mice of high dose group showed significant less time and distance in the target quadrant compared with con2
t rol group. Conclusion Mice of chronic subcutaneous D2gal injection showed serious object recognition impair2
ment , the object recognition test is more sensitive than Morris water maze in reflectin g the learning and memory
impairment in this model .
【Key words】 D2galactose ; Learning and memory ; Object recognition ; Water maze ; Brain aging
物體識(shí)別測(cè)試(Object Recognition Test)是利用動(dòng)
物先天對(duì)新物體有探索傾向的原理而建立的學(xué)習(xí)記憶
測(cè)試方法。該方法具有讓鼠在自由活動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)
習(xí)記憶測(cè)試的特點(diǎn) ,能更近似地模擬人類(lèi)的學(xué)習(xí)記憶
行為。本研究擬應(yīng)用物體識(shí)別方法研究 D2半乳糖長(zhǎng)
期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力 ,并與水迷
宮行為學(xué)測(cè)試相比較 ,為促進(jìn)物體識(shí)別測(cè)試方法在我
國(guó)學(xué)術(shù)界的應(yīng)用提供借鑒材料。
材料與方法
一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模
因 C57BL/ 6 近交系小鼠已被證明有良好物體識(shí)
別與空間記憶能力 ,以及隨衰老而記憶力減退規(guī)
律[1 ,2 ]
,本實(shí)驗(yàn)選用 C57BL/ 6 小鼠 ,3 月齡 ,雌性 ,體質(zhì)
量(20 ±2) g ,購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心(許可證
號(hào):SCXK(京) 200220001) ,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后 ,隨機(jī)分
成正常對(duì)照組、 D2半乳糖低劑量組、 D2半乳糖高劑量
組。小鼠均在無(wú)特殊致病原(SPF)級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)至行
為學(xué)測(cè)試前。低劑量組每日于背部皮下注射 D2半乳
糖(購(gòu)自 Sigma 公司 , G5388) 50mg/ kg ,高劑量組每日
皮下注射 D2半乳糖 100mg/ kg ,對(duì)照組注射等量生理
鹽水 ,連續(xù) 8 周。
二、行為學(xué)測(cè)試
1. 物體識(shí)別試驗(yàn):造模 8 周后 ,參考 Ennaceur
等[3 ]
方法進(jìn)行物體識(shí)別試驗(yàn) ,裝置主要由一個(gè)測(cè)試盒
(自制)與 2 套(每套 2 只)測(cè)試物體組成 ,測(cè)試物體在
實(shí)驗(yàn)前經(jīng)篩選有近似的小鼠喜好程度。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試盒
以 45cm×35cm×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。物體 A 套為藍(lán)色方形硬塑兒童玩具 ,約 4. 5cm ×
4. 5cm×5 cm ,B 為白色圓柱形塑料盒 ,底面直徑 4cm ,
高7cm ,兩物體均足夠重以防止小鼠推動(dòng)。測(cè)試環(huán)境
要求在隔音、避光的場(chǎng)所。在測(cè)試盒上方以 60W白光
燈照射使盒內(nèi)無(wú)陰影處。
測(cè)試主要分適應(yīng)期、熟悉期和識(shí)別期。第 1 天為
適應(yīng)期:在上述條件下 ,將鼠放入測(cè)試盒的中間 ,盒內(nèi)
未放任何物體 ,讓其自行適應(yīng)性活動(dòng) 10min。第 2 天
為熟悉期:在測(cè)試盒中放入 2 個(gè)相同的玩具(AA 或
BB) ,距離長(zhǎng)軸(45cm)兩側(cè)壁 8cm ,將鼠從盒中距物體
等距離處放入。測(cè)試者兩手各握 1 只秒表(上海秒表
廠(chǎng)) ,每只秒表對(duì)著 1 個(gè)動(dòng)物 ,開(kāi)始紀(jì)錄其在每個(gè)物體
上的探索時(shí)間(以鼠嘴湊近物體約 2cm 范圍內(nèi)計(jì)時(shí) ,
鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則不能計(jì)入) ,
以秒表間斷累積計(jì)時(shí)測(cè)定鼠探索每個(gè)物體的時(shí)間總
和 ,為在第 3 天的計(jì)時(shí)提供練習(xí)。第 3 天為識(shí)別測(cè)試
期:將另外一套中的一個(gè)物體替換前**中的一個(gè)玩
具放入盒內(nèi)(AB 或BA) ,將鼠放在盒中距兩物體等距
離處 10min。每只鼠測(cè)試完成后 ,用酒精擦拭物體以
消除鼠停留在物體上的氣味 ,并且按次序輪流調(diào)換各
物體在盒內(nèi)的位置 ,以消除鼠對(duì)物體在盒內(nèi)位置喜好
程度不同而帶來(lái)的影響。
為進(jìn)一步減少兩種物體本身差異對(duì)鼠探索時(shí)間比
較的影響 ,本實(shí)驗(yàn)以?xún)晌粶y(cè)試者在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用兩
個(gè)相同裝置測(cè)試每組的一半動(dòng)物 ,但兩裝置中的物體
相對(duì)應(yīng)鼠的新舊次序相反(如 A 在一測(cè)試者為新物體
在另一測(cè)試者則為舊物體) 。鼠的物體識(shí)別能力以第
3 天探索新舊物體的時(shí)間 ,并以探索時(shí)間計(jì)算分辨指
數(shù)(discrimination index ,DI)來(lái)評(píng)價(jià)。分辨指數(shù)計(jì)算公
式為:DI = (N2F) / (N + F) ×100 % ,式中 N 為在探索
新物體所用的時(shí)間 ,F為探索舊物體所用的時(shí)間。
2. Morris水迷宮:由 4d 的訓(xùn)練期和第 5 天的空
間探索試驗(yàn)組成 ,見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5 ]。
結(jié) 果
一、 D2半乳糖對(duì) C57 小鼠物體識(shí)別能力的影響
D2gal 兩個(gè)劑量組動(dòng)物探索新物體所用的時(shí)間較
對(duì)照組減少具有顯著性意義( P < 0. 05) (圖 1A) ;高
劑量組分辨指數(shù)較對(duì)照組減低的差異具有非常顯著性
意義 ( P < 0. 001) ,低劑量與對(duì)照組的比較也存在顯
著性意義( P < 0. 05) (圖 1B) 。這些差異顯示 D2gal
致腦老化鼠在50mg/ kg和100mg/ kg兩劑量對(duì)新舊物
體的分辨能力均減低 ,有明顯的物體識(shí)別記憶障礙
二、 D2半乳糖對(duì) C57 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影
響
在 4d 的 Morris 水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練中 ,
D2gal高劑量組動(dòng)物逃逸潛伏期比對(duì)照組延長(zhǎng)有顯著
性意義( P < 0. 01) ,而 D2gal 低劑量組逃逸潛伏期與
對(duì)照組比尚未達(dá)到顯著意義( P = 0. 088) (圖 2A) 。
在空間探索試驗(yàn)中 ,與正常對(duì)照組比較 ,高劑量組在目
標(biāo)象限所停留時(shí)間與游泳距離均減少 ,達(dá)顯著性意義(
P < 0. 05) ;而低劑量組差異未達(dá)顯著性意義
三、統(tǒng)計(jì)方法
各組動(dòng)物在物體識(shí)別試驗(yàn)的新舊物體探索時(shí)間、
分辨指數(shù)和在水迷宮空間探索中在目標(biāo)象限所停留時(shí)
間與距離比以單因素方差分析結(jié)合 Post Hoc2Duncan
法進(jìn)行組間比較分析;4d Morris水迷宮中的逃逸潛伏
期(從入水到找到站臺(tái)的時(shí)間)以重復(fù)測(cè)量的雙因素方
差分析進(jìn)行比較分析。數(shù)據(jù)以 x ±s 表示。
結(jié) 果
一、 D2半乳糖對(duì) C57 小鼠物體識(shí)別能力的影響
D2gal 致腦老化鼠在50mg/ kg和100mg/ kg兩劑量對(duì)新舊物
體的分辨能力均減低 ,有明顯的物體識(shí)別記憶障礙。二、 D2半乳糖對(duì) C57 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影
響
在 4d 的 Morris 水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練中
D2gal高劑量組動(dòng)物逃逸潛伏期比對(duì)照組延長(zhǎng)有顯著
性意義( P < 0. 01) ,而 D2gal 低劑量組逃逸潛伏期與
對(duì)照組比尚未達(dá)到顯著意義( P = 0. 088) (圖 2A)
在空間探索試驗(yàn)中 ,與正常對(duì)照組比較 ,高劑量組在目
標(biāo)象限所停留時(shí)間與游泳距離均減少 ,達(dá)顯著性意義
P < 0. 05) ;而低劑量組差異未達(dá)顯著性意義(圖 2B)
      討 論
本研究發(fā)現(xiàn) D2半乳糖長(zhǎng)期皮下注射可導(dǎo)致小鼠
出現(xiàn)顯著的物體識(shí)別記憶能力障礙。而且用物體識(shí)別
測(cè)試方法比 Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型
小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。鼠的物體識(shí)別能力與海馬[4 ]
、
基底前腦[5 ]
和嗅周皮層[6 ]
等腦區(qū)功能有關(guān) ,受自由基
損傷[4 ]
以及腦內(nèi)單胺遞質(zhì)含量[7 ]
等因素影響。Morris
水迷宮測(cè)試的空間學(xué)習(xí)記憶能力與海馬、紋狀體、基底
前腦、小腦等腦功能區(qū)域[8 ]
有關(guān)。D2半乳糖可造成鼠腦皮層與海馬自由基損傷[9 ]
、腦內(nèi)單胺遞質(zhì)含量減
少[10 ]
,可能是導(dǎo)致其物體識(shí)別以及空間學(xué)習(xí)記憶能力
減低的原因。Luparini 等[11 ]
發(fā)現(xiàn)在物體識(shí)別測(cè)試中出現(xiàn)的老
年鼠輕度記憶損害現(xiàn)象在 Morris水迷宮測(cè)試中消失 ,
與我們的研究結(jié)果類(lèi)似。造成這兩種學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方
法敏感性不同的可能原因有二: ①鼠的精神狀態(tài)。在
物體識(shí)別測(cè)試中 ,鼠始終處于自主活動(dòng)的狀態(tài) ,是在日
常精神穩(wěn)定狀態(tài)下進(jìn)行的測(cè)試;而在水迷宮中 ,鼠去找
平臺(tái)是在害怕沉水的應(yīng)激下進(jìn)行 ,應(yīng)激本身可導(dǎo)致學(xué)
習(xí)記憶能力下降。②兩種行為測(cè)試方法所依賴(lài)的腦功
能區(qū)域不同。近年來(lái)的研究證據(jù)表明 ,物體識(shí)別與嗅
皮質(zhì)或嗅周皮質(zhì)有高度相關(guān) ,如細(xì)胞毒性造成大鼠的
嗅皮質(zhì)損傷只造成物體識(shí)別能力損害而空間記憶保
持[5 ]
,而空間學(xué)習(xí)記憶能力似乎比物體識(shí)別記憶更依
賴(lài)于海馬功能 ,如海馬 CA3 區(qū)域的部分損傷以及后海
馬的神經(jīng)毒性損傷可導(dǎo)致 Morris 水迷宮空間識(shí)別障
礙而無(wú)物體識(shí)別能力的損傷表現(xiàn)[12 ,13 ]
,D2半乳糖致腦得進(jìn)一步研究。
我們應(yīng)用物體識(shí)別測(cè)試方法的體會(huì)主要有: ①在
測(cè)試盒內(nèi)光線(xiàn)要充足 ,不能留有陰暗處或裂縫; ②測(cè)試
物體在要實(shí)驗(yàn)前作鼠喜好性篩選 ,并且足夠大以引起
鼠的注意; ③測(cè)試者在測(cè)試第 2 天需訓(xùn)練秒表間斷連
續(xù)計(jì)時(shí)法以使第 3 天能熟練計(jì)時(shí); ④測(cè)試過(guò)程中更換
兩物體在測(cè)試盒內(nèi)的位置 ,并只在鼠探索物體時(shí)才計(jì)
時(shí); ⑤該法測(cè)試時(shí)間相對(duì)長(zhǎng) ,在需測(cè)動(dòng)物數(shù)較多時(shí)可以
兩人同時(shí)進(jìn)行?？傊?,物體識(shí)別測(cè)試方法簡(jiǎn)便、靈敏 ,
適合學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機(jī)理及**學(xué)研究。